mRNA疫苗非臨床組織分布研究方法探討

發布時間:2022.05.11 13:47:13

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      mRNA疫苗是一類新型的核酸疫苗,被接種到機體后能作為模板編碼病原體或癌細胞產生的外原蛋白誘導和激活機體的免疫系統產生免疫反應,從而達到預防和治療疾病的目的。

     隨著核酸修飾和遞送載體技術的發展,mRNA疫苗的臨床轉化逐漸得以實現,并被廣泛用于傳染性疾病、腫瘤和罕見病的研發。mRNA疫苗的非臨床研究,不僅要遵循針對疫苗的相應指導原則,如WHO分別針對疫苗及其佐劑的指導原則,還應滿足2021年WHO出臺的評估預防性傳染病的mRNA疫苗的質量、安全性和有效性的監管考慮內容。該內容明確提出mRNA疫苗的非臨床研究需闡明mRNA和脂質納米粒(LNP)遞送載體或其成分在體內的分布情況以及留存時間。

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        mRNA疫苗組織分布的研究方法包括定量和定性分析兩大類。定量分析mRNA在組織中含量可使用逆轉錄定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)。定性分析方法可采用正電子發射計算機斷層顯像(PET-CT)、近紅外成像技術結合、免疫熒光技術以及放射性同位素標記法等。

1、RT-qPCR

RT-qPCR是一種高度靈敏的技術,可定量檢測到很低拷貝數的RNA。它首先以mRNA為模板,在逆轉錄酶的催化下合成互補DNA(cDNA),然后再以cDNA為模板通過qPCR擴增目的基因。在變性-退火-延伸的循環反應中,DNA產物的量呈指數型增長,體系中熒光分子發出的信號與DNA產物的量成正比并被實時分析,從而計算出PCR產物的量。在mRNA疫苗的非臨床組織分布研究中,受試動物被解剖后其血液、骨髓、膝關節、肌肉大腦、心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結和注射部位肌肉等常需進行mRNA含量的分析。血液和骨髓可以直接用于mRNA的提取,而一些較大的組織臟器被隨機選取部分位點勻漿后用于mRNA的提取,經過逆轉錄獲取cDNA后進行qPCR擴增。RT-qPCR的體系需要經過優化并經驗證,比如方法的檢測限、標準曲線的定量范圍、精密度和準確度、特異性、選擇性以及基質干擾等。目前,對于qPCR和RT-qPCR用于基因和細胞治療藥物的分析方法尚未有具體的行業指南和法規,所以各評價機構對于方法的驗證內容和接受標準也各不相同。

2、PET-CT與近紅外成像技術

PET是將標記有能發射正電子的放射性同位素的化合物注射到受檢者體內,讓受檢者在PET的有效視野范圍內進行呈像,CT是根據組織對X射線吸收不等的特點而得到的受檢者的解剖結構圖像。兩者的融合,既能提供受檢者體內被標記化合物的信息,又能對被標記化合物進行精確定位。從而,在臨床上為查找和確定腫瘤及病灶提供精確的位置信息,并為定性定量診斷提供依據。Santangelo課題組首次將無損傷性PET-CT和近紅外成像結合對mRNA疫苗在食蟹猴中的組織分布做了追蹤和檢測。在該研究中,黃熱?。╕F)prME mRNA被選作為模型系統,放射性同位素64Cu被標記在能與抗原mRNA的3’端互補配對的近紅外熒光探針上,所以將mRNA疫苗注射至食蟹猴體內后,由PET-CT和近紅外成像技術檢測到的放射性64Cu和近紅外熒光信號就暗示了mRNA在體內的存在和位置。

3、免疫熒光技術與放射性同位素標記法

在mRNA疫苗組織分布研究中,除了直接檢測mRNA分子外,也可以通過免疫熒光技術檢測mRNA翻譯的病原蛋白間接追蹤和分析mRNA。免疫熒光技術是利用抗原抗體反應的特異性結合的原理,首先將已知的抗體標記上熒光分子并將其作為探針,通過熒光顯微鏡的觀察從而定位細胞或組織中的抗原物質。由于熒光免疫技術特異性強,靈敏度高,所以在臨床和非臨床的病理診斷和檢驗中應用廣泛。熒光素酶具有生物發光特性常被用于生物發光成像分析,熒光素酶mRNA作為報告基因可以在體內翻譯出熒光蛋白,在熒光顯微鏡下可以觀察其在細胞和組織中的定位。在已批準上市的COVID-19mRNA疫苗Comirnaty的非臨床試驗中,研究人員使用熒光素酶mRNA替代病原體mRNA在小鼠體內做了mRNA的組織分布研究,同時還將熒光素酶mRNA經同位素3H標記的脂質納米粒包裹后注射到大鼠體內,對mRNA和其LNP遞送載體兩者均做了組織分布研究,更加全面分析mRNA疫苗的潛在靶器官。根據實驗的觀察結果,使用3H標記脂質納米粒的方法表現了出比熒光素酶更高的靈敏度。

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      基于人們對疾病基因相關機制認識的不斷深入和mRNA疫苗自身的優勢,我們相信mRNA疫苗在未來必將得到突飛猛進的發展,而對mRNA疫苗組織分布的研究方法也必將更多樣、更高效和更靈敏,更好的為mRNA疫苗的開發、非臨床和臨床研究服務。成都華西海圻作為一家專業從事藥物非臨床試驗與國際接軌的GLP中心之一,緊跟新藥研發的前沿方向,在mRNA疫苗的非臨床安全性、有效性、組織分布等研究方面已積累了豐富經驗,可以為客戶提供國內、美國、歐盟、日本、韓國等多邊申報服務,我們期待與更多的新藥研發單位合作。








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